癫痫(epilepsy)是儿科神经系统常见疾病，其中近30%的患者通过规范的药物治疗不能有效控制发作，成为难治性癫痫，颞叶癫痫(temporal lobe epilepsy, TLE)是难治性癫痫的最常见类型[1]。海马是与颞叶癫痫形成密切相关的脑区，有研究提示海马与神经发生有关，越来越多的证据显示，成年海马在生理或病理状态下都存在着神经发生过程[2]。

Wnts是一组分泌性糖蛋白，它们参与调节神经发育，被认为是干细胞生物学主要的生理调节因子[3]。Wnt蛋白介导的Wnt信号通路对海马神经发生起着重要作用，它调控着神经干细胞(neural stem cells, NSCs)早期增殖和晚期成熟分化等重要的发育过程，阻断Wnt信号通路可以消除齿状回海马神经发生[4]。在调控海马神经发生的众多Wnt蛋白中，Wnt7a能通过Wnt信号通路调节NSCs增殖分化、促进神经前体细胞成熟，还能调节海马神经元突触囊泡周期和突触传导[5]，但其调控海马神经发生的确切机制尚不清楚。为明确Wnt7a是否调控颞叶癫痫大鼠的海马神经发生，参与颞叶癫痫的形成，本文将利用KA点燃颞叶癫痫动物模型模拟颞叶癫痫的形成过程，并检测不同时期Wnt7a mRNA和蛋白的表达。

一、材料

1.实验动物分组：实验动物按观察处理时间分为KA点燃1周组、4周组和8周组，每个时间点分为两组，即红藻氨酸(KA)组和生理盐水NS对照组，每组动物各6只。

2.红藻氨酸点燃癫痫模型的制备：生后30 d的雄性SD大鼠(哈尔滨医科大学附属第二医院动物室提供)，体重85～100 g，按12 mg/kg体重皮下注射KA(生产单位：Sigma公司，)，此剂量足以诱发动物出现癫痫持续状态以及自发性再发抽搐[6]。在KA点燃后60 min可出现Racine描述的不同等级的癫痫行为[7]，本研究所有动物均出现Racine描述的Ⅳ以上癫痫行为，说明癫痫模型制备成功。对照组动物皮下注射相同剂量的生理盐水。

3.实验动物处理：各实验组动物处理当日均正常进食水，各组动物分别在相应的观察处理时间结束时，经10%的水合氯醛按400 mg/kg腹腔注射麻醉，断头取脑，快速分离双侧海马，迅速放入液氮中, 后转入-80℃冰箱备用。

二、方法

1. Real-time PCR检测Wnt7a mRNA:利用Trizol法提取各组动物海马组织总RNA，采用紫外分光光度计根据260/280比值测RNA浓度和纯度。采用cDNA反转录试剂盒(RocketScript RT Premix; Bioneer; South Korea)，进行cDNA反转录，实验操作按产品说明书进行。采用扩增试剂盒进行PCR扩增，以β-actin作内参。扩增程序包括95℃10 min，95℃ 20sec×40个循环，55℃退火和延伸1 min，预期获得1 078bp片段。引物序列(博仕生物公司)如下，即

Wnt7a上游5′- CTCAAGCTTCGAATTCGCCACC ATGACCCGGAAAGCGCG-3′

下游5′- CCATGGTGGCGAATTCCTTGCACGTA TACATCTCTGTGC-3′

β-actin：上游 5′-TGGAATCCTGTGGCATCCATG AAAC-3′

下游5′-TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTC CG-3′

采用2-△△CT法对数据进行定量分析。

2.Western blot检测 Wnt7a 蛋白:预冷RIPA蛋白抽提试剂(中国海门市碧云天生物技术研究所)，加入蛋白酶抑制剂提取海马组织蛋白，采用BCA法进行蛋白定量，将蛋白终浓度调整为4 mg/ml。根据目的蛋白的分子量，配制12%的分离胶，浓缩胶浓度为5%，待检测蛋白以20 微克/孔进行电泳，用湿转法转移到NC膜上，将膜完全浸没3%BSA-TBST中室温轻摇30 min封闭。用3%BSA-TBST稀释一抗(兔多克隆抗体，1:500，美国santa cruz公司)，室温孵育10 min，放4℃过夜。第二天把膜放在室温孵育30 min，TBST洗膜5次，每次3 min。用5%脱脂奶粉-TBST稀释二抗(山羊抗兔第二抗体，1:10000，北京天德悦生物科技有限责任公司)，室温轻摇 40 min，TBST洗膜6次，每次3 min。ECL(美国Millipore公司)加到膜上后反应3～5 min，胶片曝光20 s，显影2 min，定影30 s，冲洗胶片。用Quantity One 软件4.6.2版本(美国Bio-Rad)对各反应条带进行数据分析，并用β-actin作内参将数据标准化。

3.统计学处理:应用SPSS 22.0软件进行统计分析，实验结果均以均数±标准差表示，多样本均数比较采用方差分析，方差不齐时采用秩和检验，两样本均数比较采用t或t’检验。检验水准P